هپاتیت B

هپاتیت B (هپاتیت ب ) چیست؟

 

هپاتيتهاي ويروسي مخصوصا هپاتیت ب يكـي از پـنج عامـل عفـوني مـرگ زودرس بشر در سطح جهان ميباشند و هرسـال حـداقل يـك ميليون نفر از جمعيت جهان در اثر هپاتيتهاي ويروسي تلـف ميشـوند.

تاکنون 6 نوع ویروس هپاتیت  A،B،C،D،E،G هپاتيـت ويـروس نـوع ٦ تـاكنون. شناخته شده است و احتمال ميرود كه حداقل دو نوع ويروس ديگر F,H نيز به زودي شناسـايي شـوند. از بـين ويروسـهاي شـناخته شـده فقـط نـوع B (هپاتیت ب ) از خـانواده DNAاسـت و بقيـه  RNA ويروس هستند. بغير از ويروسهاي نوع AوE كه بدون پوشش بوده و ازطريق خوردن و آشـاميدن منتقـل مـيگردنـد، ساير ويروسها (ويروسـهاي نـوع G،D،C،B ) همگـي داراي پوشش ميباشند و از طريق خون و مشتقات آن به انسان منتقل ميشوند. شايعترين علـت هپاتيـت حـاد ويروسـي در بـالغين ايراني نـوع HBV مـيباشـد.</h2<

هپاتیت ب Hepatitis B یك بیماری عفونی ناشی از ویروسی با همین نام است (Hepatitis B Virus/HBV).

این بیماری در تقریباً تمام كشورهای جهان وجود دارد و یكی از مشكلات عمده بهداشت جهانی بشمار می رود. در حال حاضر حدود2  میلیارد نفر در دنیا به این ویروس مبتلا می باشند كه در نزدیك به 350 میلیون نفر آنها بیماری به صورت مزمن بوده و ناقل این عفونت محسوب می گردند.

ویروس هپاتیت B می تواند باعث عفونت و التهاب کبد شود. یک فرد می تواند بدون این که بداند، به ویروس آلوده شده و آن را انتقال بدهد. بعضی از افراد علائم خاصی ندارند، برخی از آنها تنها عفونت اولیه را تجربه می کنند، اما بعضی دیگر به طور مکرر عفونت می کنند، چون ویروس همچنان بدون این که تشخیص داده شود، به کبد حمله می کند؛ آسیب برگشت ناپذیر کبد می تواند نتیجه آن باشد.

دلایل بیماری هپاتیت ب (هپاتیت B)  چیست ؟

 

هپاتیت B بوسیله عفونت بدن با ویروس هپاتیت B ایجاد می شود. ویروس هپاتیت B یا HBV، در خون و مایعات بدن یافت می شود. این ویروس، می تواند از طریق اسپرم، مایعات واژینال و خون منتقل شود و پس از زایمان از مادر به نوزاد منتقل شود. سوزن های اشتراکی و داشتن رابطه جنسی بدون محافظت نیز، این خطر را افزایش می دهد.

افراد زمانی که به بخشی از جهان مسافرت می کنند که عفونت در آنجا شایع تر است، بیشتر به بیماری مبتلا می شوند. یک فرد می تواند شرایط بیماری را بدون آگاهی گسترش دهد، زیرا ممکن است علامتی نداشته باشد.

آزمایش و تشخیص هپاتیت B  

 

تشخیص دقیق  بیماری هپاتیت ب (B) در کنترل این بیماری بسیار مهم می باشد. تحقیقات نشان می دهند كه مطمئن ترین روش برای بررسی و مدیریت درمان این بیماری، ارزیابی میزان ویروس در خون بیمار می باشد بر این اساس می توان مرحله بیماری را تعیین نمود و موفقیت درمان را نیز سنجید و در عین حال گونه های جدید ویروس را كه به درمان مقاوم می باشند به سرعت تشخیص داد.

مطمئن ترین و دقیق ترین روش ها  جهت تشخیص هپاتیت ب (B) روش  Real-Time PCR است.

كیت های مولکولی با برند نوین ژن امكان بررسی نمونه جهت تشخیص و تعیین تیتر ویروس هپاتیت ب را به روش Real-Time PCR  (ریل تایم پی سی آر) فراهم می كند كه در حال حاضر در مقایسه با سایر روش های ارزیابی میزان ویروس، دارای بیشترین حساسیت و وسیع ترین دامنه اندازه گیری می باشد. در این روش با استفاده از پروب های نشاندار شده به رنگ های فلورسنت می توان محصول PCR را بررسی نمود. بر همین اساس می توان تعداد ویروس را در نمونه مورد بررسی تعیین نمود بدون این كه پس از پایان واكنش نیاز به انجام مراحل بعدی باشد. با توجه به این كه در این روش نیازی به بررسی محصول PCR وجود ندارد، احتمال ایجاد آلودگی نیز به لحاظ تئوری وجود نخواهد داشت. کیت های مولکولی نوین ژن برای استفاده با دستگاه های Rotor-Gene و Step One  و یا سایر دستگاه های ریل تایم پی سی آر موجود در آزمایشگاه ها طراحی شده است. این كیت همچنین حاوی كنترل داخلی می باشد كه از گزارش منفی كاذب حاصل از ناكارآمدی استخراج DNA یا مهار PCR پیشگیری می كند.

کیت های ریل تایم پی سی آر نوین ژن با بیش از ده سال سابقه تولید و راه اندازی و  پشتیبانی مسئولین فنی خبره از مرحله خرید تا نصب و راه اندازی کیت در آزمایشگاه ها، نمونه ای موفق از محصول ایرانی با کیفیت می باشد.

شرایط نگه داری و پایداری کیت های مولکولی نوین ژن HBV

 

تمامی مواد كیت باید در دمای 20 درجه زیر صفر حمل و نگهداری شوند. در این صورت این مواد تا پایان زمان انقضا كیت كه روی كیت و نیز روی هر لوله درج شده است پایدار و قابل استفاده می باشند.

از ذوب و انجماد مكرر این مواد و بیش از سه بار خودداری كنید زیرا باعث كاهش حساسیت و عدم كارایی آن ها می شود.

 

موارد مورد نیاز انجام آزمایش HBV

برای استفاده از این كیت به تجهیزات و اقلام زیر نیاز دارید:

  • دستگاه Real-Time PCR به همراه تجهیزات جانبی آن
  • سانتریفوژ مخصوص میكروتیوب
  • ورتكس (Vortex Mixer )
  • بلوک حرارتی رومیزی(Dry Block Heater )
  • سمپلر متغیر و سر سمپلر فیلتردار( Nuclease free )
  • كیت استخراج DNA
  • تیوب 1/7میلی لیتری و میكروتیوب مخصوص Real-Time PCR
  • دستكش لاتكس یا نیتریل بدون پودر
  • بلوک آلومینیومی (بلوک سرد)

برای پیشگیری از تولید نتایج كاذب به نكات زیر توجه كنید:

هنگام كار با نمونه بیمار، همیشه فرض را بر آلوده بودن نمونه بگذارید وخطرات بالقوه آن را در نظر داشته باشید.

  • در فضای pre-PCR یا Clean Room سه ناحیه را مشخص و از هم تفكیك كنید. این سه فضا شامل فضای نگهداری نمونه و استخراج، فضای آماده سازی مواد )برای افزودن میكس به لوله های PCR ( و فضای آماده سازی واكنش )برای افزودن نمونه DNA به لوله PCR ( می باشند. هر یك از سه فضای فوق باید وسایل مخصوص به خود، به ویژه سمپلر، را داشته باشند. از جابجایی وسایل بین این سه فضا پرهیز كنید.
  • سطوح كار را همیشه قبل از شروع و پس از خاتمه كار با الكل 70 درجه تمیز كنید.
  • هنگام استفاده، مواد كیت را روی یخ خرد شده نگه دارید تا كاملاً ذوب شده و با چند تكان ملایم از مخلوط و یكنواخت شدن محتویات هر لوله اطمینان حاصل كنید. سپس برای چند ثانیه آن ها را در دور پایین سانتریفوژ كنید.
  • در حین كار، محتویات كیت را همیشه روی یخ خرد شده نگه داری كنید. از استفاده یخ های قالبی و سایر موارد به غیر ا یخ خرد شده پرهیز كنید.
  • در حین كار، میكروتیوب های PCR را روی بلوک آلومینیوم از پیش سرد شده گذاشته، و از گذاشتن آنها بر یخ خرد شده خودداری كنید

عوامل مزاحم: هپارین با غلظت بیش از 10 واحد در میلی لیتر باعث مهار PCR می شود. به همین دلیل لوله حاوی هپارین به عنوان ضد انعقاد مناسب نیست و نباید استفاده شود. همچنین نمونه بیماران تحت درمان با هپارین نیز برای PCR مناسب نمی باشد. مقادیر بالای بیلیروبین )تا حداكثر 5 / 4 میلی گرم در دسی لیتر(  و چربی ) تا حداكثر1000 میلی گرم در دسی لیتر( و نیز همولیز خون برای این آزمایش مزاحمتی ایجاد نمی كند .

 

نمونه مناسب، شرایط نگهداری و انتقال کیت مولکولی HBV برند نوین ژن

 

نمونه مناسب برای آزمایش هپاتیت ب با این كیت، پلاسمای خون محیطی(peripheral blood) می باشد كه در لوله استریل حاوی ماده ضد انعقاد جمع آوری شده است. ماده ضد انعقاد می تواند EDTA یا سیترات باشد. خون كامل را می توان تا 72 ساعت در 4 درجه نگهداری و به آزمایشگاه منتقل نمود.  هنگام دریافت نمونه در آزمایشگاه باید پس از سانتریفوژ پلاسمای آن را جدا نموده و در دمای 20 درجه زیر صفر نگهداری نمود. نمونه پلاسما در چنین شرایطی تا چندین هفته پایدار بوده و تیتر ویروس در آن ثابت می ماند.

حداقل نمونه توصیه شده برای آزمایش 200 میكرولیتر پلاسما می باشد كه نیازمند نیم میلی لیتر خون كامل می باشد.

استخراج DNA

 

برای استخراج DNA از نمونه پلاسما از روش ها و كیت های مختلفی می توان

استفاده نمود. ما استفاده از كیت های زیر را توصیه می كنیم:

  • High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Cat# 11858874001, Roche Applied Science, Mannheim, Germany)
  • QIAamp DNA Blood Mini Kit (Cat. no. 51104, Qiagen GmbH, Hilden, Germany)
  • QIAampUltraSens ® Virus Kit (Cat. no. 53704, Qiagen GmbH, Hilden, Germany)
  • QIAampMiniElute Virus Spin Kit (Cat. no. 57704, Qiagen GmbH, Hilden, Germany)

در صورتی كه تمایل دارید استخراج DNA از نمونه را با استفاده از كنترل داخلی بررسی نمایید،

 

كنترل داخلی

 

برای ارزیابی احتمال استخراج نامناسب یا مهار واكنش و جلوگیری از نتایج منفی كاذب، این كیت حاوی كنترل داخلی میباشد. كنترل داخلی را میتوانید در مرحله استخراج استفاده نموده یا صرفاً در مرحله  PCRآن را به HBV Mix اضافه نمایید. در حالت اول، كنترل داخلی علاوه بر بررسی مهار واكنش، نشانگر كیفیت استخراج نیز می باشد. برای استفاده در مرحله استخراج، كنترل داخلی را پس از افزودن بافر lysis به نمونه، اضافه كنید. میزان مورد نیاز از كنترل داخلی ده درصد حجم حلال نهایی ) elution buffer ( میباشد. یعنی در صورتی كه DNA را نهایتاً در 100 میكرولیتر بافر حل میكنید، 10 میكرولیتر از كنترل داخلی را به مخلوط نمونه و بافر Lysis اضافه نمایید. توجه داشته باشید كه كنترل داخلی نباید مستقیماً به نمونه بیمار )یعنی پیش از افزودن بافر lysis ( اضافه شود زیرا كارآیی خود را از دست خواهد داد.

در صورتی كه كنترل داخلی را به HBV Mix اضافه می نمایید، تنها می توانید مهار واكنش PCR را بررسی كنید. به این منظور به ازای هر واكنش PCR ، یك میكرولیتر از كنترل داخلی را به HBV Mix اضافه نمایید. به طور مثال برای 10 واكنش به 150 میكرولیتر از میكس، 10 میكرولیتر كنترل داخلی اضافه كنید و مخلوط حاصل را مطابق توضیحات قسمت 10 استفاده نمایید. در صورت موفق بودن PCR كنترل داخلی منجر به تولید فلورسانس با تابش زرد (VIC/Yellow) و CT بین 31 تا 37 می شود.

 

ابتدا تمامی لوله ها را روی یخ خرد شده قرار دهید تا بطور كامل محتویات آنها ذوب شوند. با چند تكان ملایم از مخلوط شدن مواد داخل آنها اطمینان حاصل كرده و برای چند ثانیه آنها را در دور پایین سانتریفوژ كنید.

تعداد مورد نیاز لوله PCR روی بلوک سرد بگذارید. علاوه بر تعداد نمونه های مورد آزمایش، 5 لوله برای استانداردها و یك لوله برای كنترل منفی نیز در نظر بگیرید.

در صورتی كه كنترل داخلی را در حین استخراج وارد كرده اید، به هر لوله مستقیماً 15 میكرولیتر از Mix HBV اضافه كنید.

در صورتی كه مایلید كنترل داخلی را به Mix HBV اضافه نمایید، مطابق توضیحات قسمت 9 كنترل داخلی را به میكس افزوده و 15 میكرولیتر از مخلوط حاصل را به هر لوله منتقل كنید.

در پایان 10 میكرولیتر از DNA استخراج شده، استاندارد یا آب به هر لوله اضافه كنید.”

درپوش لوله ها را ببندید. سپس آن ها را مطابق شماره ها داخل دستگاه قرار دهید.

توجه: در صورت استفاده از دستگاه StepOne لوله ها را ابتدا به مدت كوتاهی سانتریفوژ نموده و سپس داخل دستگاه قرار دهید.

توجه: هنگام استفاده از دستگاه روتورژن، رینگ محافظ را نیز در پایان اضافه كنید.

 

برای تنظیم کیت روی دستگاه های ریل تایم پی سی آر و انجام آزمایش، پشتبانان فنی کیت های نوین ژن همراه شما هستند و با حضور در محل آزمایشگاه و نصب و راه اندازی و پشتیبانی به شما در کسب دقیق ترین  نتیجه آزمایش یاری می رسانند.

جهت سفارش و  خرید این کیتها از مرجع تخصصی کالا و خدمات پزشکی ، سلامت و آزمایشگاهی اینجا را کلیک کنید.