Taq polymerase یک DNAپلیمراز نوع یک است که در حرارت بالا فعالیت میکند. نام این پلیمراز را از نام باکتری گرما دوست Thermus aquaticus گرفتهاند و در ابتدا در سال 1976میلادی توسط Chien و همکارانش از این باکتری جدا شد. این آنزیم که با نام اختصاری Taq pol ماده اغلب در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) ، روشی برای تکثیر مقدار کمی از بخش های کوتاه DNA استفاده می شود.
1.aquaticus منبع آنزیم تک پلیمراز:
Thermus aquaticus گونهای از باکتری است که میتواند درجه حرارت بالا را تحمل کند، یکی از چندین باکتری ترموفیلیک که متعلق به گروه Deinococcus-Thermus است. این باکتری منبع آنزیم مقاوم در برابر حرارت تک پلیمراز است. حداکثر رشد این باکتری در دمای 70 درجه سانتیگراد (158 درجه فارنهایت) می باشد، اما میتواند در دمای 50 تا 80 درجه سانتیگراد (122 درجه فارنهایت تا 176 درجه فارنهایت) زنده بماند. این باکتری یک شیمیوتروف است و برای بدست آوردن مواد غذایی شیمیوسنتز انجام می دهد. با این حال، از آنجا که دامنه دما آن تا حدودی با Cyanobacteria فتوسنتزی که محیط ایده آل خود را به اشتراک می گذارد، همپوشانی دارد، در بعضی مواقع با زندگی مشترک با همسایگان خود، انرژی لازم برای رشد از فتوسنتز آنها به دست میآورد.
ساختار:
ساختار تک پلیمراز به صورت کلی شبیه به ساختار Pol A درE. coli دارد. قسمت میانی که فعالیت 3’ به 5’ اگزونوکلئازی دارد و مسئول تصحیح مجدد رشته ی رونویسی شده را دارد، به طور چشمگیری تغییر کرده است و کاربردی نیست. دومین دیگر فعالیت 5’ به 3’ اگزونوکئازی داشته و در قسمت n ترمینال رشته واقع شده است، برخلاف دومین مشابه در پلیمراز E. coli که موجب تخریب پرایمر میشود.
اثر دما بر آنزیم تک پلیمراز:
دمای مطلوب تک پلیمراز برای فعالیت 75 الی 80 درجه سانتیگراد است؛ با نیمهعمر حدود 2 ساعت در 5/92 درجه
سانتیگراد، 40 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد و 9 دقیقه در دمای 5/97 درجه سانتیگراد است. تک پلیمراز میتواند یک رشته 1000 جفت پایه DNA را در کمتر از 10 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد رونویسی کند. در دمای 75-80 درجه سانتیگراد، تک پلیمراز به سرعت پلیمریزاسیون مطلوب خود، یعنی حدود 150 نوکلئوتید در ثانیه برای هر مولکول آنزیم میرسد و هرگونه انحراف از محدوده دمای مطلوب مانع از افزایش سرعت آنزیم میشود. تک پلیمراز در دمای 70 درجه سانتیگراد حدود 60 نوکلئوتید در ثانیه، در 55 درجه سانتیگراد 24 نوکلئوتید در ثانیه، در 37 درجه سانتیگراد 5/1 نوکلئوتید در ثانیه و در 22 درجه سانتیگراد 25/0 نوکلئوتید در ثانیه سنتز میکند. در دماهای بالاتر از 90 درجه سانتیگراد، تک پلیمراز فعالیت بسیار کم یا ناچیزی را از خود نشان میدهد، اما ساختار آنزیم تغییری نکرده و دست نخورده باقی میماند. پس ممکن است سنتز DNA، در دماهای بالاتر در شرایط آزمایشگاهی به خاطر پایداری پرایمر و یا رشته الگو محدود شود.
اثر عوامل محیطی دیگر بر عملکرد آنزیم تک پلیمراز:
وجود یونهای خاصی در لولهی واکنش نیز بر فعالیت خاص آنزیم تأثیر میگذارد. مقادیر کمی کلرید پتاسیم (KCl) و یون منیزیم (Mg+2) فعالیت آنزیمی تک پلیمراز را تقویت می کنند. تک پلیمراز حداکثر در 50 میلی مولار از KCl و غلظت مناسب Mg+2، که با غلظت نوکلئوزید تری فسفاتها (dNTPs) تعیین میشود، فعال میشود. غلظت بالای KCl و Mg+2 فعالیت تک پلیمراز را مهار میکند. غلظت کم اوره، DMSO ، DMF یا فرمالدئید هیچ تاثیری در فعالیت اتصال تک پلیمراز ندارد. حضور DMSO ممکن است بر Tm پرایمرها، مشخصات فعالیت حرارتی تک پلیمراز تاثیرگذار باشد. جالب توجه است که اتانول ده درصد نمیتواند فعالیت تک پلیمراز را مهار کند و اوره یک مولار باعث تحریک فعالیت آن میشود. این تأثیرات بر فعالیت اتصال تک پلیمراز ممکن است میزان تأثیر این عوامل بر PCR را منعکس نکند؛ به عنوان مثال ، اوره نیم مولار کاملاً آزمایش PCR را مهار میکند.
جدول1: اثرات مواد بازدارنده بر فعالیت Taq Pol I
|
Activity* |
Concentration | Inhibitor |
|
100% 110% |
≤ 3%
10% |
Ethanol |
|
100% 118% 107% 82% |
≤0.5 M
1.0 M 1.5 M 2.0 M |
Urea |
|
100% 53% 11% |
≤ 1%
10% 20% |
DMSO |
|
100% 82% 17% |
≤ 5%
10% 20% |
DMF |
|
100% 86% 39% |
≤ 10%
15 % 20% |
Fonnamide |
|
105% 10% <.1% |
.001%
.01% .1% |
SDS |
*فعالیت در هفتاد درجهی سانتیگراد،
استفاده از تک پلیمراز در PCR:
در اوایل دهه 1980میلادی، کری مولیس در شرکت Cetus مشغول به کارگیری DNAهای مصنوعی در بیوتکنولوژی بود. او به استفاده از الیگونوکلئوتیدهای DNA به عنوان پروب اتصال به رشتههای DNA هدف، و همچنین استفاده از آنها به عنوان پرایمرهای توالی یابی DNA و سنتز cDNA آشنا بود. او در سال شروع به استفاده از دو پرایمر، برای هیبریداسیون به هر رشته از DNA هدف و اضافه کردن DNA پلیمراز به واکنش کرد؛ این امر منجر به تکثیر نمایی DNA شد.
پس از هر دور از تکثیر، باید مخلوط بالای 90 درجه سانتیگراد گرم شود تا به رشتهها اجازه دهد ازهم جدا شده و DNA جدید تشکیل شود. همین مرحله از گرمایش موجب تخریب DNA پلیمراز تهیه شده از E. coli بود.
استفاده از تک پلیمراز از لحاظ دما ، امکان اجرای PCR را در دمای بالا (60 درجه سانتیگراد و بالاتر) فراهم آورد. همچنین، استفاده از یک پلیمراز مقاوم در برابر دما بالا نیاز به افزودن آنزیم جدید ببعد از هر دور چرخهی حرارتی را از بین برد. یک لوله بسته منفرد در یک دستگاه نسبتاً ساده میتواند برای انجام کل مراحل مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین، استفاده از تک پلیمراز علت اصلی بود که باعث شد PCR برای طیف وسیعی از مشکلات زیست شناسی مولکولی در رابطه با تجزیه و تحلیل DNA کاربرد داشته باشد.
همچنین تک پلیمراز محصولات دی ان ای را تولید می کند که دارای دنبالهی آدنین (A) در انتهای 3’ خود هستند؛ این دنباله میتواند در کلونینگ TA مفید باشد و به یک حامل کلونینگ (مانند پلاسمید) که دارای انتهای تیمین (T) است، متصل شود.
ایجاد خطا در PCR:
تشابه محصول ایجاد شده توسط PCR با الگوی اولیه چقدر مهم است؟ پاسخ این سوال به ماهیت تحقیق اجام شده بستگی دارد. در بسیاری از موارد خطاهای تصادفی در توالی نوکلئوتیدی که ممکن است در طول PCR تولید شود، نگرانی چندانی ندارند. با این حال، برخی از تحقیقات وابسته به PCR شامل خصوصیات منحصر به فرد مولکول DNA یا مولکول های نادر موجود در یک جمعیت ناهمگن است. مثالها شامل مطالعه پلی مورفیسم آللی در رونوشت های mRNA یا مولکولهای تک DNA است. در این شرایط، وفاداری (میزان خطا در هر نوکلئوتید) PCR یک نکته مهم است زیرا خطاهای ایجاد شده در طول تکثیر ممکن است در تفسیر داده ها دخالت کند. اکثر این تغییرات در توالی نوکلئوتیدی را می توان به خطاهای ایجاد شده توسط DNA پلیمراز نسبت داد. همانطور که از داده های جدول 2 مشاهده میشود ، فرکانسهای خطایی مشاهده شده در طول PCR متفاوت است.
جدول 2: تخمین میزان خطا به تعداد نوکلئوتید در طول PCR که توسط تک پلیمراز کاتالیز شده است
|
Error rate per nucleotide per cycle * |
Error frequency per nucleotide | Number of cycles | Target sequence |
|
1/5.600 |
22/8.000 | 30 | Apolipoprotein B |
|
1/5,900 |
17/6.692 | 30 |
HLA-DPβ |
|
1/11.000 |
7/4.700 | 33 | R-Antit rypsin |
|
1/15.000 |
16/15.000 | 32 | HPRT |
|
1/16.000 1/18.000 |
20/21.870
17/30.710 |
30
20 |
HLA-A,B |
|
1/19.000 |
1/1.500 | 25 | TCR Vδ |
|
<1/83,000 |
<1/5,411 | 30 | HIV gag/env |
* نرخ خطا = 1 / [(مشاهده فرکانس خطا / تعداد چرخه ها) x 2]، با فرض راندمان ثابت در هر چرخه.
نسبت مولکولهای DNA که حاوی تغییرات توالی هستند تابعی از میزان خطا در هر نوکلئوتید در هر چرخه، تعداد چرخهی تکثیر و اندازه جمعیت آغازین است. جمعیت مولکولهای تغییر یافته DNA در طول PCR از دو منبع (1) خطاهای جدید در هر چرخه و (2) تقویت به وجود میآید. به طور متوسط، همان تعداد توالی DNA در جمعیت نهایی تغییر میکند که ناشی از خطاهای پلیمراز در آخرین چرخه تکثیر در نتیجهی تکثیر خطاهای رخ داده در چرخه های قبلی است.
در فرمول f =np/2، میانگین فرکانس جهش را توصیف می کند؛ تکثیر موجود در PCR را به عنوان تابعی از میزان خطای پلیمراز در هر نوکلئوتید در هر چرخه را با p و تعداد چرخهها (با فرض اینکه p در هر چرخه ثابت باشد) با را n مشخص میکنند. از لحاظ نظری، فرکانس تغییرات دنباله DNA را می توان با تغییر تعداد چرخه(n) یا میزان خطای پلیمراز در هر نوکلئوتید (p) کنترل کرد. فراوانی جهشهای حذف وابسته به توالی است و در توالی های DNA تکراری افزایش می یابد. رایجترین خطای حذف صورت گرفته توسط پلیمراز حذف یک نوکلئوتید است. این مسئله به این خاطر میباشد که فعالیت 3’ به 5’ اگزونوکلئازی در تک پلیمراز جهت تصحیح قرائت وجود ندارد و در نتیجه دقت نسبتاً در آن کاهش مییابد. برخی از DNA پلیمرازهای قابل استفاده در دما بالا از سایر باکتریهای ترموفیلیک جدا شدهاند، مانند Pfu DNA polymerase ، که دارای یک فعالیت تصحیح قرائتند و در ترکیب با تک پلیمراز مورد استفاده قرار می گیرند. ایجاد شرایط محیطی مساعد که پارهای از آنها در بالا ذکر شد نیز میتواند به کاهش نرخ خطا کمک کند.
منابع:
- Gelfand, D. H. (1989). Taq DNA Polymerase. PCR Technology, 17–22
- Eckert, K. A., & Kunkel, T. A. (1991). DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research, 1(1), 17–24.
- ALICE CHIEN, DAVID B. EDGAR, AND JOHN M. TRELA*. JOURNAL OF BAcTESRIoLOGY, Sept. 1976, p. 1550-1557
- https://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase
برای بررسی و تهیه آنزیم تک پلیمراز وارد بخش ملزمات آزمایشگاهی شوید .
از اینکه این مقاله را مطالعه نمودید سپاسگزاریم .