آنزیم Taq DNA Polymerase

Taq polymerase

Taq polymerase یک DNAپلیمراز نوع یک است که در حرارت بالا فعالیت می­کند. نام این پلیمراز را از نام باکتری گرما دوست Thermus aquaticus گرفته­اند و در ابتدا در سال 1976میلادی  توسط Chien و همکارانش از این باکتری جدا شد. این آنزیم که با نام اختصاری Taq pol ماده اغلب در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) ، روشی برای تکثیر مقدار کمی از بخش های کوتاه DNA استفاده می شود.

1.aquaticus منبع آنزیم تک پلیمراز:

Thermus aquaticus گونه­ای از باکتری است که می­تواند درجه حرارت بالا را تحمل کند، یکی از چندین باکتری ترموفیلیک که متعلق به گروه Deinococcus-Thermus است. این باکتری منبع آنزیم مقاوم در برابر حرارت تک پلیمراز  است. حداکثر رشد این باکتری در دمای 70 درجه سانتیگراد (158 درجه فارنهایت) می باشد، اما می­تواند در دمای 50 تا 80 درجه سانتیگراد (122 درجه فارنهایت تا 176 درجه فارنهایت) زنده بماند. این باکتری یک شیمیوتروف است و برای بدست آوردن مواد غذایی شیمیوسنتز انجام می دهد. با این حال، از آنجا که دامنه دما آن تا حدودی با Cyanobacteria فتوسنتزی که محیط ایده آل خود را به اشتراک می گذارد، همپوشانی دارد، در بعضی مواقع با زندگی مشترک با همسایگان خود، انرژی لازم برای رشد از فتوسنتز آنها به دست می­آورد.

ساختار:

ساختار تک پلیمراز به صورت کلی شبیه به ساختار Pol A درE. coli  دارد. قسمت میانی که فعالیت 3’ به 5’ اگزونوکلئازی دارد و مسئول تصحیح مجدد رشته ­ی رونویسی شده را دارد، به طور چشمگیری تغییر کرده است و کاربردی نیست. دومین دیگر فعالیت 5’ به 3’ اگزونوکئازی داشته و در قسمت n ترمینال رشته واقع شده است، برخلاف دومین مشابه در پلیمراز E. coli که موجب تخریب پرایمر می­شود.

اثر دما بر آنزیم تک پلیمراز:

دمای مطلوب تک پلیمراز برای فعالیت 75 الی 80 درجه سانتیگراد است؛ با نیمه­عمر حدود 2 ساعت در 5/92 درجه

سانتیگراد، 40 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد و 9 دقیقه در دمای 5/97 درجه سانتیگراد است. تک پلیمراز   می­تواند یک رشته 1000 جفت پایه DNA را در کمتر از 10 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد رونویسی کند. در دمای 75-80 درجه سانتیگراد، تک پلیمراز به سرعت پلیمریزاسیون مطلوب خود، یعنی حدود 150 نوکلئوتید در ثانیه برای هر مولکول آنزیم می­رسد و هرگونه انحراف از محدوده دمای مطلوب مانع از افزایش سرعت آنزیم می­شود. تک پلیمراز در دمای 70 درجه سانتیگراد حدود 60 نوکلئوتید در ثانیه، در 55 درجه سانتیگراد 24 نوکلئوتید در ثانیه، در 37 درجه سانتیگراد 5/1 نوکلئوتید در ثانیه و در 22 درجه سانتیگراد 25/0 نوکلئوتید در ثانیه سنتز می­کند. در دماهای بالاتر از 90 درجه سانتیگراد، تک پلیمراز فعالیت بسیار کم یا ناچیزی را از خود نشان می­دهد، اما ساختار آنزیم تغییری نکرده و دست نخورده باقی می­ماند. پس ممکن است سنتز DNA، در دماهای بالاتر در شرایط آزمایشگاهی به خاطر پایداری پرایمر و یا رشته الگو محدود شود.

اثر عوامل محیطی دیگر بر عملکرد آنزیم تک پلیمراز:

وجود یونهای خاصی در لوله­ی واکنش نیز بر فعالیت خاص آنزیم تأثیر می­گذارد. مقادیر کمی کلرید پتاسیم (KCl)  و یون منیزیم  (Mg+2)  فعالیت آنزیمی تک پلیمراز را تقویت می کنند. تک پلیمراز حداکثر در 50 میلی مولار از KCl و غلظت مناسب Mg+2، که با غلظت نوکلئوزید تری فسفات­ها (dNTPs) تعیین می­شود، فعال می­شود. غلظت بالای KCl و Mg+2 فعالیت تک پلیمراز را مهار می­کند.  غلظت کم اوره، DMSO ، DMF یا فرمالدئید هیچ تاثیری در فعالیت اتصال تک پلیمراز ندارد. حضور DMSO ممکن است بر Tm پرایمرها، مشخصات فعالیت حرارتی تک پلیمراز تاثیرگذار باشد. جالب توجه است که اتانول ده درصد نمی­تواند فعالیت تک پلیمراز را مهار کند و اوره یک مولار باعث تحریک فعالیت آن می­شود. این تأثیرات بر فعالیت اتصال تک پلیمراز ممکن است میزان تأثیر این عوامل بر PCR را منعکس نکند؛ به عنوان مثال ، اوره نیم مولار کاملاً آزمایش PCR را مهار می­کند.

جدول1:  اثرات مواد بازدارنده بر فعالیت Taq Pol I

Activity*

ConcentrationInhibitor

100%

 110%

≤ 3%

10%

Ethanol

100%

 118%

 107%

 82%

≤0.5 M

1.0 M

1.5 M

2.0 M

Urea

100%

 53%

11%

≤ 1%

10%

20%

DMSO

100%

82%

17%

≤ 5%

10%

20%

DMF

100%

 86%

 39%

≤ 10%

15 %

20%

Fonnamide

105%

 10%

 <.1%

.001%

.01%

.1%

SDS

*فعالیت در هفتاد درجه­ی سانتی­گراد،

استفاده از تک پلیمراز در PCR:

در اوایل دهه 1980میلادی، کری مولیس در شرکت Cetus مشغول به کارگیری DNAهای مصنوعی در بیوتکنولوژی بود. او به استفاده از الیگونوکلئوتیدهای DNA به عنوان پروب اتصال به رشته­های DNA هدف، و همچنین استفاده از آن­ها به عنوان پرایمرهای توالی یابی DNA و سنتز cDNA آشنا بود. او در سال شروع به استفاده از دو پرایمر، برای هیبریداسیون به هر رشته از DNA هدف و اضافه کردن DNA پلیمراز به واکنش کرد؛ این امر منجر به تکثیر نمایی DNA شد.

پس از هر دور از تکثیر، باید مخلوط بالای 90 درجه سانتیگراد گرم شود تا به رشته­ها اجازه دهد ازهم جدا شده و DNA جدید تشکیل شود. همین مرحله از گرمایش موجب تخریب DNA پلیمراز تهیه شده از E. coli بود.

استفاده از تک پلیمراز از لحاظ دما ، امکان اجرای PCR را در دمای بالا (60 درجه سانتیگراد و بالاتر) فراهم آورد. همچنین، استفاده از یک پلیمراز مقاوم در برابر دما بالا نیاز به افزودن آنزیم جدید ببعد از هر دور چرخه­ی حرارتی را از بین برد. یک لوله بسته منفرد در یک دستگاه نسبتاً ساده می­تواند برای انجام کل مراحل مورد استفاده قرار گیرد. بنابراین، استفاده از تک پلیمراز علت اصلی بود که باعث شد PCR برای طیف وسیعی از مشکلات زیست شناسی مولکولی در رابطه با تجزیه و تحلیل DNA کاربرد داشته باشد.

همچنین تک پلیمراز محصولات دی ان ای را تولید می کند که دارای دنباله­ی آدنین (A) در انتهای 3’ خود هستند؛ این دنباله می­تواند در کلونینگ TA مفید باشد و به یک حامل کلونینگ (مانند پلاسمید) که دارای انتهای تیمین (T) است، متصل شود.

ایجاد خطا در PCR:

تشابه محصول ایجاد شده توسط PCR با الگوی اولیه چقدر مهم است؟ پاسخ این سوال به ماهیت تحقیق اجام شده بستگی دارد. در بسیاری از موارد خطاهای تصادفی در توالی نوکلئوتیدی که ممکن است در طول PCR تولید شود، نگرانی چندانی ندارند. با این حال،  برخی از تحقیقات وابسته به PCR شامل خصوصیات منحصر به فرد مولکول DNA یا مولکول های نادر موجود در یک جمعیت ناهمگن است. مثالها شامل مطالعه پلی مورفیسم آللی در رونوشت های mRNA یا مولکول­های تک DNA است. در این شرایط، وفاداری (میزان خطا در هر نوکلئوتید) PCR یک نکته مهم است زیرا خطاهای ایجاد شده در طول تکثیر ممکن است در تفسیر داده­ ها دخالت کند. اکثر این تغییرات در توالی نوکلئوتیدی را می توان به خطاهای ایجاد شده توسط DNA پلیمراز نسبت داد. همانطور که از داده های جدول 2 مشاهده می­شود ، فرکانس­های خطایی مشاهده شده در طول PCR متفاوت است.

جدول 2: تخمین میزان خطا به تعداد نوکلئوتید در طول PCR که توسط تک پلیمراز کاتالیز شده است

Error rate per nucleotide per cycle *

Error frequency per nucleotideNumber of cyclesTarget sequence

1/5.600

22/8.00030Apolipoprotein B

1/5,900

17/6.69230

HLA-DPβ

1/11.000

7/4.70033R-Antit rypsin

1/15.000

16/15.00032HPRT

1/16.000

1/18.000

20/21.870

17/30.710

30

20

HLA-A,B

1/19.000

1/1.50025TCR Vδ

<1/83,000

<1/5,41130HIV gag/env

 * نرخ خطا = 1 / [(مشاهده فرکانس خطا / تعداد چرخه ها) x 2]، با فرض راندمان ثابت در هر چرخه.

نسبت مولکولهای DNA که حاوی تغییرات توالی هستند تابعی از میزان خطا در هر نوکلئوتید در هر چرخه، تعداد چرخه­ی تکثیر و اندازه جمعیت آغازین است. جمعیت مولکول­های تغییر یافته DNA در طول PCR از دو منبع (1) خطاهای جدید در هر چرخه و (2) تقویت به وجود می­آید. به طور متوسط، همان تعداد توالی DNA در جمعیت نهایی تغییر می­کند که ناشی از خطاهای پلیمراز در آخرین چرخه تکثیر در نتیجه­ی تکثیر خطاهای رخ داده در چرخه های قبلی است.

در فرمول f =np/2،  میانگین فرکانس جهش را توصیف می کند؛ تکثیر موجود در PCR را به عنوان تابعی از میزان خطای پلیمراز در هر نوکلئوتید در هر چرخه را با p و تعداد چرخه­ها (با فرض اینکه p در هر چرخه ثابت باشد) با را n مشخص میکنند. از لحاظ نظری، فرکانس تغییرات دنباله DNA را می توان با تغییر تعداد چرخه(n) یا میزان خطای پلیمراز در هر نوکلئوتید (p) کنترل کرد. فراوانی جهش­های حذف وابسته به توالی است و در توالی های DNA تکراری افزایش می یابد. رایج­ترین خطای حذف صورت گرفته توسط پلیمراز حذف یک نوکلئوتید است. این مسئله به  این خاطر می­باشد که فعالیت 3’ به 5’ اگزونوکلئازی در تک پلیمراز  جهت تصحیح قرائت وجود ندارد و در نتیجه دقت نسبتاً  در آن کاهش می­یابد. برخی از DNA پلیمرازهای قابل استفاده در دما بالا از سایر باکتری­های ترموفیلیک جدا شده­اند، مانند Pfu DNA polymerase ، که دارای یک فعالیت تصحیح قرائتند و در ترکیب با تک پلیمراز مورد استفاده قرار می گیرند. ایجاد شرایط محیطی مساعد که پاره­ای از آنها در بالا ذکر شد نیز میتواند به کاهش نرخ خطا کمک کند.

منابع:

  • Gelfand, D. H. (1989). Taq DNA Polymerase. PCR Technology, 17–22
  • Eckert, K. A., & Kunkel, T. A. (1991). DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research, 1(1), 17–24.
  • ALICE CHIEN, DAVID B. EDGAR, AND JOHN M. TRELA*. JOURNAL OF BAcTESRIoLOGY, Sept. 1976, p. 1550-1557
  • https://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase

برای بررسی و تهیه آنزیم تک پلیمراز  وارد بخش ملزمات آزمایشگاهی شوید .

از اینکه این مقاله را مطالعه نمودید سپاسگزاریم .

 

برچسب ها: